抗體標記試劑盒 (Antibody Labeling Kits)

該試劑盒用於製備標記抗體,每個抗體具有2.5-3個標記。該試劑盒包含十個標記反應的所有試劑和材料,每個反應可標記100 ug 抗體。該染料是一種 NHS 酯,要控制使用量。它在弱鹼性 pH 條件下與抗體上的賴氨酸氨基基團發生反應。抗體的純化是通過使用矽膠離心柱來實現的。這些試劑盒包含磺化水溶性染料,最適合標記包括抗體在內的敏感蛋白。

套件組成

套件組成部分 數量
1321-10rxn
10 反應
3321-10rxn
10 反應
7321-10rxn
10 反應
5321-10rxn
10 反應
6321-10rxn
10 反應
1821-10rxn
10 反應
6821-10rxn
10 反應
N1320, sulfo-Cyanine3 NHS酯 (sulfo-Cyanine3 NHS ester), 1 rxn 10
N3320, 磺基-Cyanine5 NHS 酯 (sulfo-Cyanine5 NHS ester), 1 rxn 10
N7320, 磺基-Cyanine5.5 NHS酯 (sulfo-Cyanine5.5 NHS ester), 1 rxn 10
N5320, 磺基-Cyanine7 NHS 酯 (sulfo-Cyanine7 NHS ester), 1 rxn 10
N6320, 磺基-Cyanine7.5 NHS酯 (sulfo-Cyanine7.5 NHS ester), 1 rxn 10
N1820, AF 488 NHS 酯 (AF 488 NHS ester), 1 rxn 10
N2825, AF 594 NHS酯 (AF 594 NHS ester), 1 rxn 10
A1115, Desalting spin column, PBS, 1 pcs 10 10 10 10 10 10 10
16115, Desalting receptacle vial, 1.5 mL, 10 pcs 1 1 1 1 1 1 1
17115, Desalting waste vial, 2 mL, 10 pcs 1 1 1 1 1 1 1
11125, PBS tablet, for 100 mL of buffer, 1 pcs 1 1 1 1 1 1 1
15050, DMSO (dimethyl sulfoxide), labeling grade, 1 mL 1 1 1 1 1 1 1
1584-05mL, Sodium azide solution, 3%, 0.5 mL 1 1 1 1 1 1 1
1689-15mL, Sodium bicarbonate, 126 mg 1 1 1 1 1 1 1

保存期限 12 個月。

方法

1. 抗體製備

標記反應的最佳條件如下:抗體以1 mg/mL的濃度溶解在0.1 M碳酸氫鈉溶液中。疊氮化鈉與標記試劑兼容。如果抗體濃度低於1 mg/mL,則需濃縮。抗體製備應不含氨基酸、BSA 等蛋白質以及會使 pH 值處於(2-7.5 或 9-12)不利範圍的緩衝液成分。

2. 設置反應

2.1. 將含抗體的碳酸氫鈉溶液(100 ug/100 uL*)添加到熒光團中,渦旋,並在室溫下孵育 30 分鐘。

如果要標記的抗體量較少,則將凍干染料溶解在10 uL無水DMSO中,每10 ug抗體取1 uL溶液。染料溶於DMSO後,應儘快使用。

3. 標記抗體的純化

3.1.準備離心過濾柱。使用前,柱子應於室溫平衡。使用渦旋重新懸浮凝膠。將柱子放入適配的無蓋管中,以 1,000 g 離心 2 分鐘(必須仔細控制轉速對於標準 6 cm 轉子,1,000 g = 3,800 rpm)。柱子的凸出部分應朝外。

3.2. 用 400 uL的 1x PBS 緩衝液潤洗,以 1,000 g 離心 2 分鐘。

3.3.取出柱子。將其放入帶蓋的收集管中。將 100 uL 反應混合物上柱,孵育 1 分鐘, 1,000 g 離心 2 分鐘洗脫抗體。添加 1/100體積的 100x 疊氮化鈉。抗體可以分裝以延長其保質期。現用抗體可以儲存在+4 °С,其餘的可以儲存在-20 °С。

4. 染料與抗體比值的測定

計算染料抗體比,測量偶聯物的吸收光譜,即在280 nm (AAB) 或染料最大吸收峰 (ADye) 處的吸收值。染料標記抗體的典型吸收光譜如下圖所示。根據染料的不同,最大吸收波長可能會有所不同。

標記抗體的吸收光譜包含染料峰(具有較長的波長)和抗體峰(280 nm 左右)。染料與抗體比使用以下公式計算:

其中 Dye/AB — 每個抗體分子的平均熒光團數,ADye — 樣品在染料最大吸收處的光密度,AAB — 280 nm 處的樣品光密度,εAB — 280 nm 處抗體的摩爾消光係數(IgG 為 210,000), εDye — 染料在最大吸收時的摩爾消光係數(見下表),CF280 — 染料的校正因子(見下表)。

計算示例

用sulfo-Cyanine5標記IgG抗體並純化後,得到吸收光譜如上圖。確定染料與蛋白質的比例。

由吸收光譜可得,染料最大吸收值(646 nm,見表)時的ADye = 0.184, IgG的 AAB = 0.066(280 nm),εAB = 210,000; ε染料 = 271,000,CF280 = 0.04。

染料/AB — 每個抗體有 2.43 個熒光團分子。

結果的判讀和抗體儲存

在大多數情況下,最佳染料與抗體比是每個抗體 2-3 個染料分子。由於熒光濃度猝滅,染料負載量增加到該值以上並不會改善熒光信號。當反應過程中附着的熒光團太少時,降低每次反應的抗體上樣量。使用過期的試劑盒也會導致這種結果。

我們建議檢測標記抗體與其抗原的結合。標記的抗體可保存在-20°С。當前使用的試樣應儲存在 +4 °С 下,以避免凍融循環。偶聯物的穩定性由抗體本身決定,而不是由熒光團或化學鍵決定。標記的抗體不應長時間暴露在陽光直射下,但可耐受環境光照。

相關套件

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即用型試劑盒,使用 AF 594 染料通過NHS酯化學作用標記抗體和蛋白質。該試劑盒包含所有必需的化學品和消耗品。
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